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Jun 27, 2023

赤キャベツエキス

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 2056 (2023) この記事を引用

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2 引用

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

細菌性病原体は、人体にさまざまな深刻な感染症を引き起こし、死に至ることによって人命に脅威を与えることさえあります。 腸内細菌科の種、特にウレアーゼ陽性菌であるプロテウス ミラビリス (P. ミラビリス) および肺炎桿菌 (K. ニューモニエ) は、抗生物質に対して耐性を示し、呼吸器および尿路感染症を引き起こします。 当社は、ミラビリス菌と肺炎桿菌を迅速、高感度、経済的に検出するための、肉眼とスマートフォンによる読み取りを備えた天然インジケーターを組み込んだ比色ウレアーゼ検査を開発しました。 私たちは、赤キャベツ (Brassica oleracea) 抽出物の主要成分として見つかったアントシアニンを、有毒な合成指示薬の代わりに天然の pH 指示薬として利用しました。 ミラビリスと肺炎桿菌の検出のメカニズムとしては、ミラビリスと肺炎桿菌から分泌されるウレアーゼ酵素が尿素を加水分解してアンモニア (NH3) を生成し、これにより反応環境の pH 値が上昇し、脱プロトン化が引き起こされます。アントシアニンから。 アントシアニンの分子構造と電子構造の変化により、さまざまな色が現れます。 私たちは、細菌の濃度 (コロニー形成単位、CFU)、テスト中のアントシアニンの濃度、テストの初期色および pH 値 (pH) などのいくつかの反応パラメータが検出性能にどのように影響するかを実証しました。 さらに、検出限界を向上させ、検出時間を短縮するために、スマートフォンベースのデジタル画像処理ソフトウェアを備えた 3D プリントスマートフォンプラットフォームを開発しました。 私たちは、人間の目とスマートフォンの画像処理によって評価される比色測定値を提供する天然インジケーターを組み込んだ迅速ウレアーゼ検査は、実用化に大きな可能性を秘めており、臨床で実装できると主張します。

プロテウス ミラビリス (P. mirabilis) およびクレブシエラ ニューモニエ (K. pneumoniae) 株は、ヒトの糞便菌叢および消化管全体で無害に検出されますが 1、これらは別々にまたは一緒に呼吸器および尿路に定着し、バイオフィルムを形成することによって重篤な単独感染または同時感染を引き起こします 2。 、3、4。 これらのウレアーゼ陽性菌とグラム陰性菌は、広域抗生物質に対する耐性を獲得しており、医学界の不安を増大させています。 これらの病原体によって引き起こされる生命を脅かす感染症に加えて、間接的に膀胱結石や腎臓結石の形成を誘発します。 簡単に言えば、病原体から放出されるウレアーゼ酵素が尿素を加水分解してアンモニア (NH3) を形成し、アルカリ性尿中に不溶性の多価アニオンとカチオンからなるさまざまなサイズの結晶が形成されます 5、6、7、8。

前述したこれらの問題に加えて、今日では、広域抗生物質の即時処方や、これらの病原体が検出されるまでの間違った治療も、患者の健康に悪影響を与えるだけでなく、耐性の出現を引き起こす重大な問題となっています。 これらすべての問題に対処するために、病原体を検出するための迅速かつ高感度な検査を開発することが強く求められています。 現在臨床で使用されている遺伝子型検査法がいくつかありますが、高価な装置や専門家が必要であることが、これらの方法の大きな欠点となっています9、10、11。

ここで我々は、裸眼およびスマートフォンベースのデジタル画像処理システムを用いて、ミラビリス菌および肺炎桿菌株の増殖を迅速かつ高感度かつ比色検出するための、天然指示薬ベースのウレアーゼ検査を初めて開発した。 指標であるアントシアニン分子は、特に赤キャベツ抽出物 (RCE) から得られるシアニジン 3-O-ジグルコシド-5-O-グルコシドの構造に基づいています。 アントシアニンは生体適合性があり、非常に小さな pH 変化に対してさまざまな色で反応します。 アントシアニンのこれらの特性を利用して、細菌の診断検査に使用されています12。 アントシアニンは幅広い pH 依存性のカラー スケールを持っているため、テストの最初の色をデザインできます。

肉眼による試験溶液の色の変化の観察は、細菌の増殖または存在の検出における定性分析を提供しましたが、半定量的な結果は、Delta-E (ΔE) および RGB (赤、緑、青）の分析。 私たちは、両方の読み出しシステムが比較的費用対効果が高く、持ち運び可能なツールとして考えられ、ポイントオブケア (POC) 検査や診療所でさまざまな微生物を検出するために実装できることを約束します。

トリプティック大豆寒天 (Merck、ドイツ)、Columbia 寒天ベース (BD、ドイツ)、スキムミルク培地 (Difco、米国)、リン酸二水素ナトリウム一水和物 (NaH2PO4.H2O、メルク、ドイツ)、リン酸二水素ナトリウム無水物 (Na2HPO4、メルク、ドイツ）、アジ化ナトリウム（NaN3、ドイツ、メルク）、および尿素（ドイツ、メルク）は、記載されている会社から購入しました。 微生物：Escherichia coli ATCC 25922 (E. coli)、K. pneumoniae ATCC 700603、およびP. mirabilis ATCC 12453は、エルジェス大学薬学部、製薬微生物研究所ATCC培養コレクションから入手しました。 P. ミラビリスと K. ニューモニエは、スキムミルク培地中で -20 °C で保存され、実験前に再生されました。 光学密度は、分光光度計(AzureAo、Azure Biosystems, Inc.)によって測定した。

商品化された赤キャベツは、トルコのカイセリ県にある地元のミマール シナン市場（北緯 38 度 43 分 38.3 秒、東経 35 度 31 分 30.6 秒）で購入されました。 研究で使用された赤キャベツは、トルコでの取引および商品化が許可されており、合法です。 したがって、地方自治体からの特別な許可は必要ありませんでした。 赤キャベツの葉をシュレッダーにかけて細かく切りました。 １００グラム（ｇ）の物質を、１００ｍＬの蒸留水が入った５００ｍＬビーカーに入れた。 混合物を 30 分間煮沸することにより抽出プロセスにさらしました。 得られた赤キャベツの葉抽出物を濾過し、さらに使用するために -20 °C で保存しました。

アントシアニンベースの迅速ウレアーゼ試験を準備するために、まず 0.01 M PBS をオートクレーブで 121 °C で 15 分間滅菌しました。 次いで、１００ｍＬの０．０１Ｍ滅菌ＰＢＳ、２ｇの尿素、２０ｍｇのＮａＮ ３ および２０％ｗ／ｗのＲＣＥを混合することによって試験溶液を調製した。 最後に、得られた試​​験溶液を細菌の検出に使用する前に、孔径 0.45 μm のメンブレンフィルターで濾過しました。

K. pneumoniae および P. mirabilis 株を、5% の滅菌羊血液を含むトリプシン大豆寒天およびコロンビア寒天ベース中で 37 °C で増殖させました。 K. pneumoniae および P. mirabilis 株を、異なる濁度で 3 mL の生理食塩水に懸濁しました 13、14。 大腸菌株は、報告されているプロトコールに基づいて培養されました15。

デジタル画像処理では、アントシアニン試験溶液を含むチューブを白い背景に置き、色の変化をスマートフォンのカメラ (Apple iPhone 7 plus) で撮影し、すべての写真を JPEG 形式で保存しました。 アントシアニン試験溶液の画像は、視覚的な比色分析結果を定量的に裏付けるために、ImageJ ソフトウェア (国立衛生研究所) によって分析されました。 RGB (赤、緑、青) 分析の平均値とユークリッド距離は、ImageJ ソフトウェアを使用して計算されました。 このソフトウェアを使用すると、キャプチャされた画像内のすべてのピクセルが赤、緑、青の成分に分離され、R、G、または B チャネルの平均値が計算されます16、17。 定量分析で使用されるもう 1 つの分析方法は、CIE 1976 Lab の色差公式 17 から得られるユークリッド距離公式 デルタ E (ΔE) を適用することにより、2 つの画像間の色差を測定することに基づいています。

式中の L、a、b は CIE Lab 色空間の寸法を表し、L 軸は黒 (0) から白 (100) の範囲の絞りを表します。 軸の範囲は赤 (+ a) から緑 (- a) で、b 軸は黄色 (+ b) から青 (- b) を表します。 この情報に基づいて、ΔE は類似した画像のスコアを低く計算します。これは、類似した画像間のランク差を表す距離が、異なる画像間の距離よりも小さいためです18、19。 ΔE を計算するには; ΔL、Δa、Δb の値は、それぞれテスト結果画像と参照画像の L、a、b チャンネルを差し引くことで計算されました。 次のステップでは、式 1 を使用して各ピクセルの ΔE を計算しました。 1. ΔE 値は、人間の目が通常の状態で 2 つの色を区別できる指標として受け入れられています20。 したがって、ΔE 値の差が大きいほど、細菌の存在をより正確に結論付けることができます。

画像処理機能を備えたカスタムビルドのスマートフォン アプリケーションを、Android Studio IDE を使用して Kotlin で開発しました。 このアプリケーションは、Android 6 (API 23) から Android 10 (API 29) まで実行できます。 モバイル アプリには、デバイス上のカメラとファイルにアクセスできるようにイーサネット接続が必要です。 メインメニューは、メニューを開始するための「ウレアーゼテスト」ボタンで構成されています。 このインターフェイスには、試験管の挿入方法と分析用の画像のキャプチャ方法に関するガイド情報が含まれています。 サンプル チューブとリファレンス チューブを撮影した後、各テスト画像の赤緑青 (RGB) 値が計算されます。 ユークリッド距離の公式は、これらの値を使用して機能します。 分析後、すべての RGB 値、ユークリッド距離の結果、テストの最終結果が画面の下部に表示されます。 ユークリッド距離 (ED) の式 (式 2) を以下に示します21。

値が 25 以上の場合、画面に陽性のテキストが表示され、ウレアーゼ陽性細菌の存在が確認されます。 信頼性の高い精度の高い結果を得るには、(i) 写真を撮るときは画面の両側が均等に照らされる必要があり、(ii) 背景や他のものに焦点が合わないよう、カメラは可能な限り同じ位置に保つ必要があります。 これは常に可能であるとは限りません。 このため、カメラからチューブまでの距離を標準化し、均一な照明環境を得るために、スマートフォン プラットフォームが開発されました。 各サンプルの撮影時にすべての環境要因が等しいことを保証するプラットフォームのおかげで、信頼性の高い結果が得られます。

Vestel Venus Z20 によれば、スマートフォン プラットフォームはコンピューター支援設計 (CAD) ソフトウェア SolidWorks を介して設計されました。 Venus Z20 には、16 メガピクセルと 5 メガピクセルの背面カメラが搭載されています。 スマートフォン プラットフォームは、本体素材として黒色の丈夫なポリ乳酸 (PLA)、サポートとして白色のポリビニル アルコール (PVA) を使用し、Ultimaker S3 で 3D プリントされました。 光漏れを防ぐため、フィラメントは黒を選択し、充填材は20%でした。 プラットフォームとバイアルホルダーの底部と上部の 3 つの部分で構成される 3D プリント後、PVA を溶解してサポート材料から精製するために、水中に一晩放置しました。 白色発光ダイオード (LED) ストリップをバイアル ホルダーの窓の反対側に置きました。 電源ケーブルは底部のベースの穴を通して配線され、オン/オフ スイッチに接続され、次に 12 V アダプターに接続されました。 次に、上部を下部に3M 468MP両面テープで固定します。 最終製品としてのスマートフォンプラットフォームの寸法は150mm×120mm×160mm、重量は300gです。 バイアル ホルダーにはバイアル用の 2 つのリングがあり、1 つはコントロール用、もう 1 つはサンプル用です。 プラットフォームの前面にある 140 mm × 60 mm のくぼみに電話機を置いて、バイアルの写真を撮影しました。

データの分析は SPSS 20.0 プログラムを使用して実行されました。 データは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表されました。

ウレアーゼ試験は、(i) NH3 生成の主基質として使用される尿素、(ii) pH 依存性の変色特性から恩恵を受ける指示薬として機能するアントシアニン、および (iii) NH3 生成の安定剤として機能する NaN3 を含む 3 つの主要な成分で構成されています。尿素の自己加水分解の防止。 アントシアニンを使用すると、テスト環境の開始 pH 値に基づいてテストの色をデザインできます。 pH依存性の色の変化は、アントシアニンの水酸基からの脱プロトン化に依存します。 このウレアーゼ試験と読み出しシステムの動作原理は、スキーム 1 に示され、詳しく文書化されています。ウレアーゼ陽性菌として知られる肺炎桿菌とミラビリス菌は両方とも、反応を起こすために尿素の NH3 分子への加水分解を触媒するウレアーゼを放出します。アルカリ性環境。 次に、アントシアニン分子はそのヒドロキシル基を通じて脱プロトン化され、ウレアーゼテストの色の変化が肉眼とスマートフォンに統合された画像システムで体系的に観察されました。

肉眼とスマートフォンの読み出しによる、ミラビリス菌と肺炎桿菌の検出に基づく、新規の比色ウレアーゼ検査の図。

まず、テスト 1 (pH 6.5 で薄紫色)、テスト 2 (pH 8 で青色)、およびテスト 3 (pH 11 で緑色) と呼ばれる、同様の含有量 (10% w) の 3 つのウレアーゼ試験溶液を調製しました。 /w RCE:PBS (1:4)、2 μg/mL 硫酸コリスチン、尿素および NaN3)。 私たちは、比色ウレアーゼ試験の初期色または pH が、迅速性と感度の点で検出性能にどのような影響を与えるかを実証しました。 これらの試験における色の変化は、大腸菌、肺炎桿菌、およびミラビリス菌株の比色検出において肉眼およびデジタル画像処理ソフトウェア (ΔE および RGB 分析) を使用して観察されました。 実験に関しては、1.5 マクファーランド細菌懸濁液 (大腸菌、肺炎桿菌、およびミラビリス菌) 50 μl をテスト 1、テスト 2、およびテスト 3 に別々に添加し、すべてを 180 分間インキュベートしました。

図 1A は、すべてのテストで抗生物質 (硫酸コリスチン) により大腸菌が増殖せず、抗生物質の存在下での大腸菌の阻害により各テストの初期色に変化が見られなかったことを示しています。 大腸菌は尿路感染症を引き起こすことが多いウレアーゼ陰性細菌であるため、対照細菌として使用しました。 大腸菌はウレアーゼ陰性菌であり、ウレアーゼ酵素を分泌しません。 しかし、抗生物質を加えなかった実験では、大腸菌を使った試験の色がピンク色に変化することが観察されました。 ピンク色は培地が酸性であることを示します。 この状況は、大腸菌が生命活動を継続することにより、酸性の揮発性成分を環境に放出していることを示しています。 この記事の著者らの以前の研究で見られるように、細菌が繁殖を続けて生命活動を続けると、酸性の揮発性化合物を環境に放出します22、23。 この状況を知って大腸菌を抑制し、試験液の色を安定させました。 肺炎桿菌株およびプロテウス ミラビリス株のウレアーゼ酵素活性は、抗生物質の存在下でも継続します。 P. ミラビリスに対して同じプロトコールに従った場合、肺炎桿菌は 120 分、150 分、および 180 分のインキュベーションで各試験の初期色と pH の両方を変化させました (図 1B、C)。 たとえば、テスト 1 (pH 6.5) の最初の薄紫色、テスト 2 (pH 8) の青色、テスト 3 (pH 11) の緑色は、青みがかった色 (pH 7.5)、緑がかった色 (pH 8.5) に変化し、 120 分のインキュベーションで黄色 (pH 12.5)、150 分のインキュベーションで緑色 (pH 10)、緑色 (pH 11)、黄色 (pH 13)、そして緑色 (pH 11)、黄色がかった (pH 12)、および黄色 (それぞれ、180分間のインキュベーションでpH 13)。 K. pneumoniae で観察されたすべてのテストでの色と pH の変化は、P. mirabilis の検出でもほぼ同様でした (図 1C)。 各テストのΔE および RGB 分析は、肉眼で評価した色の変化とよく一致しました (図 1D、E)。 各テストの初期色が変化していないため、大腸菌はすべてのテストでΔE 値と G/B 値の両方の増加を引き起こしませんでした。 ΔE 値と G/B 値の差は、K. pneumoniae および P. mirabilis 株の検出における 120 分のインキュベーションから増加しました。

(A) 大腸菌、(B) 肺炎桿菌、および (C) ミラビリスの 1.5 マクファーランド細菌懸濁液を検出するための、肉眼でのテスト 1、テスト 2、およびテスト 3 の比色測定値。 (D) ΔE 値と E) G/B 値。 そうではない: pH 6.5-e、pH 8-e、および pH 11-e は、それらの pH 値に調整されたテストにおける大腸菌の存在を表します。 pH 6.5-k、pH 8-k、および pH 11-k は、の存在を表します。 これらの pH 値に調整されたテストでは、肺炎桿菌が検出されました。 pH 6.5-p、pH 8-p、および pH 11-p は、それらの pH 値に調整されたテストにおける P. ミラビリスの存在を表します。 エラーバーは、3 つの独立した測定 (n = 3) から得られた 1 つの標準偏差 (SD) を示します。

我々は、細菌濃度の関数として、肺炎桿菌およびミラビリス菌の検出におけるテスト 2 (pH 8 で調製) およびテスト 3 (pH 11 で調製) の性能を研究しました。 100 μl のテスト 2 に、一連の CFU/mL (1、10、102 および 103) の各細菌懸濁液 (大腸菌、肺炎桿菌、およびミラビリス) 50 μl を個別に添加しました。 各テスト 2 は 180 分間インキュベートされ、潜在的な比色読み出しは、特定の時間間隔で肉眼 (図 2A ～ C) およびスマートフォン ベースの ΔE 分析 (図 2D ～ F) で評価されました。 ０．分から１８０℃までのインキュベーション中、試験２に含まれる生理食塩水（ＳＦ）のみの初期の青色には色の変化は観察されなかった。 室温 (RT:25 °C) での min。これは、図 2A ～ C の最初の列に示すように、テスト 2 の安定性を示します。 さまざまな濃度で調製した大腸菌株の増殖は、抗生物質の使用によりテスト 2 で完全に阻害され、図 2A で人間の目で確認できるように、テスト 2 の初期の青色はすべての培養時間で一定のままでした。

(A) 大腸菌、(B) 肺炎桿菌、(C) ミラビリスに対する肉眼でのテスト 2 の比色測定値。 (D) E. coli、(E) K. pneumoniae、および (F) P. mirabilis の ΔE 値。 エラーバーは、3 つの独立した測定 (n = 3) から得られた 1 つの標準偏差 (SD) を示します。

肺炎桿菌およびミラビリス菌の懸濁液を、大腸菌の場合と同じプロトコールに従って各試験２に別々に添加した。 図 2B は、1 CFU/mL の肺炎桿菌は、十分なウレアーゼ放出がなかったため、180 分のインキュベーションでもテスト 2 の色を変えることができなかったことを示しています。 それに加えて、10、100、および1000 CFU/mLの肺炎桿菌は、150分間のインキュベーションでそれぞれ試験2の色を青色から黄色がかった色および黄色に変化させた(図2B)。 我々は、ウレアーゼの放出量は肺炎桿菌の CFU/mL の数に直接関係しており、これによりより多くの尿素が加水分解され、最終的にはより多くの NH3 分子が生成されると解釈しています。 テスト 2 の開始 pH (pH 8) は、NH3 濃度に基づいて pH 11 以上まで上昇し、その後、脱プロトン化されたヒドロキシル基の数が増加します。 図 2C は、P. ミラビリスもウレアーゼ陽性菌ですが、1 および 10 CFU/mL の P. ミラビリスでは 150 分間のインキュベーションまでテスト 2 の色が変化しませんでしたが、180 分間のインキュベーションで青色から緑色への色の変化が見られたことを明らかにしました。一番早い時間。 100 CFU/mL の P. ミラビリス株は、150 分と 180 分のインキュベーション時間の両方で緑色を示しましたが、1000 CFU/mL の P. ミラビリスでは、テスト 2 の色が 150 分と 180 分で緑色と黄色がかった色に変化しました。それぞれのインキュベーション時間。 K. pneumoniae と P. mirabilis の両方の菌株は、すべての濃度 (CFU/mL) で 12 時間のインキュベーションの最後に多くのウレアーゼ酵素を生成しました。その後、反応環境をかなりアルカリ性の条件 (pH > 12) にし、最初の色はテスト 2 (pH 8 で青色) は、サポート資料に示されているように明るい黄色に変わりました (図 S1)。

デルタ E (ΔE) 分析は、比色測定値を定量的にサポートするためにラボ製の 3D プリントされたスマートフォン プラットフォームを使用して体系的に実行され、すべてが肉眼分析と完全に一致しています。 例えば、大腸菌株は、どの濃度 (CFU/mL) およびどのインキュベーション時間でもテスト 2 の色を変化させなかったので、図 2D に見られるように、ΔE 値間の差異は計算されませんでした。 それとは対照的に、すべての濃度 (CFU/mL) の K. pneumoniae 株によって引き起こされる色の変化に基づくと、インキュベーション 150 分および 180 分で観察され、対応するインキュベーション時間で顕著に高い ΔE 値が生成されました (図 2E)。 ）。 P. ミラビリス株の存在下でΔE 値の顕著な増加が記録されましたが、肺炎桿菌によるウレアーゼの産生が多いため、肺炎桿菌の存在下では、P. ミラビリスと比較してΔE 値のより高い増加が観察されました。株（図２Ｆ）。 1 および 10 CFU/mL の P. mirabilis を使用した場合、人間の目では、インキュベーション 150 分まで、テスト 2 の初期の青色に明確な色の変化は観察されませんでしたが、デジタル画像処理では、ΔE 値の有意な増加が観察されました。分析。 このケースは、カラー画像処理システムが、人間の目でも対応する病原体の存在を検出できることを示しています。 我々の比色分析結果により、P. mirabilis 株と比較して K. pneumoniae 株の多くのウレアーゼ生産性能が明らかになったということは言及する価値があります 24。

ΔE の裏付け研究として、我々は RGB 分析を使用して、大腸菌、肺炎桿菌、およびミラビリス菌によって引き起こされる色の違いのレベルを決定しました。 図 3 は、大腸菌株がどの濃度および培養時間においても、テスト 2 の色のレベルに変化をもたらさないことを示しています。 しかし、K. pneumoniae および P. mirabilis は、特定の細菌濃度での 150 分および 180 分のインキュベーションで明確な色の変化を誘導しました。これは、G/B 値の増加に基づいて RGB 分析で計算されました。 放出されたウレアーゼの量に依存して、Ｐ．ミラビリス株と比較して、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの存在下でＧ／Ｂ値の大幅な増加が観察された。

大腸菌、肺炎桿菌、およびミラビリス菌の検出のための RGB 分析によるテスト 2 の比色測定結果。

さらに、テスト 3 のパフォーマンスに対する細菌濃度 (CFU/mL) の影響を研究しました。細菌を含まないテスト 3 の色は、インキュベーション時間に関係なく、元の緑色の変化を示さず、その優れた安定性を示しています (図の SF カラム)。図4A）。 予想通り、大腸菌増殖の阻害により、テスト 3 の反応環境の pH が変化することはなく、図 4A で人間の目で視覚的に確認できるように、テスト 3 の初期の緑色は変化しませんでした。 テスト 2 とは対照的に、テスト 3 では、1000 CFU/mL の肺炎桿菌の存在下で、90 分間のインキュベーションで緑色 (pH 11) から黄色がかった色 (pH 12) への目に見える色の変化が急速に見られました (図 4B)。 。 テスト 3 の黄色がかった色は、100 CFU/mL の肺炎桿菌でも 120 分のインキュベーションで観察されましたが、肺炎桿菌のすべての濃度で、反応媒体の pH が 12 を超えて上昇し、テスト 3 の色が変化しました。明るい黄色。 黄色に達したことは、アントシアニン分子のすべてのヒドロキシル基が脱プロトン化され、pH 12 以上での加水分解によって芳香環さえも開いたことを意味します。図 4C は、肺炎桿菌と比較して P. ミラビリスが放出するウレアーゼがはるかに少なく、ゆっくりであることをもう一度示しました。たとえば、テスト 3 の最初の色の変化は、1000 CFU/mL の P. ミラビリスの存在下、120 分間のインキュベーションで肉眼で観察されました。

(A) 大腸菌、(B) 肺炎桿菌、(C) ミラビリスに対する肉眼でのテスト 3 の比色測定値。

テスト 3 の黄色は、150 分のインキュベーションで 1000、100、10、さらに 1 CFU/mL の肺炎桿菌を含むすべての濃度の肺炎桿菌で捕捉されましたが、1000 CFU/mL の P. ミラビリスのみが捕捉できました。テスト 3 の最初の緑色を黄色に変更すると、100 CFU/mL と 10 CFU/mL の P. ミラビリスの両方で黄色がかった色になりましたが、残念ながら、同じインキュベーション時間で 1 CFU/mL の P. ミラビリスを使用した場合には色の変化は見られませんでした。 興味深いことに、試験３の色は、全濃度のＣＦＵ／ｍＬのＰ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓの存在下で、１８０分間のインキュベーションで変色した。

追加の研究として、テスト 3 の測色値も ΔE および RGB 計算で分析されました。 テスト 3 で目に見える色の変化を引き起こさなかった大腸菌は、図 5A、D に示すように、それぞれ図 5B、C と比較して、ΔE および G/B 値にも差を生じませんでした。 K. pneumoniae および P. mirabilis 株の検出における ΔE および G/B 値の両方の増加は、図 4A ～ C に示すように、テスト 3 の色の肉眼評価とよく一致していました。 ΔE および G/B 値の最初の色の違いは、1000 CFU/mL 肺炎桿菌の 90 分間のインキュベーション後に明確に示されます。 テスト 3 で K. pneumoniae および P. mirabilis の培養が増加すると、テストの緑色から黄色への変換は、ΔE および G/B 値の大幅な増加によって裏付けられました。

ΔE 値によるテスト 3 の比色測定値 (A) 大腸菌、(B) 肺炎桿菌、および (C) ミラビリス。 (D) すべての病原体の G/B 値。 エラーバーは、3 つの独立した測定 (n = 3) から得られた 1 つの標準偏差 (SD) を示します。

テスト 1 (pH 6.5)、テスト 2 (pH 8)、テスト 3 (pH 11) などの 3 つのウレアーゼ テストにおけるアントシアニン濃度の影響が、大腸菌、肺炎桿菌、P.ミラビリス。 簡単に説明すると、各細菌懸濁液 (1.5 マクファーランド) 50 μL を、40% w/w RCE:PBS (1:1) からなる各テスト 100 μL に添加し、各テストを 210 分間インキュベートしました。 各試験の初期の色は、大腸菌の存在下ではどのインキュベーション時間でも変化しませんでした（図6A）。 K. pneumoniae 株は、肉眼で視覚的に検出できるように、培養 210 分の時点でテスト 2 の青色から緑色に変化しただけでしたが、P. mirabilis 株は、同じインキュベーション時間でテスト 1 とテスト 2 の両方の初期色の変化を示しました。 (図6B、C)。 これらのテストで比色反応が遅れる潜在的な理由は、アントシアニン濃度が高いこと (40% w/w) です。 言い換えれば、これらのテストには多数のアントシアニン分子が含まれており、明確な色の変化を見るためには、一定数のアントシアニンが脱プロトン化されなければなりません。これは、細菌の濃度をより高くするか、および/またはインキュベーション時間をより長くすることで達成できます。 。

(A) 大腸菌、(B) 肺炎桿菌、(C) ミラビリスに対する肉眼でのウレアーゼ試験の比色測定値。 (D) ΔE 解析あり。 エラーバーは、3 つの独立した測定 (n = 3) から得られた 1 つの標準偏差 (SD) を示します。

ΔE 分析は、図 6A ではすべての試験で色の変化が観察されなかったため、大腸菌の存在下ではΔE 値間に差異がないことを示しています (図 6D)。 興味深いことに、肺炎桿菌の検出においてテスト 1 の最初の色が視覚的に変化しなかったとしても、120 分および 210 分のインキュベーションで ΔE 値の徐々に増加が記録されました。 それに加えて、テスト 2 では 120 分間のインキュベーションで肉眼では明確な色の変化は検出されませんでしたが、ΔE 値の許容可能な差が記録されました。 しかし、肺炎桿菌の存在下での210分間のインキュベーションで計算されたΔE値のより大きな差は、明らかな色の変化と一致しています。 これは文字通り、デジタル画像処理システムの補助的な役割を裏付けています。 P. mirabilis の検出に関しては、テスト 1 とテスト 2 の色の違いが ΔE 値で明確に計算されました。

3D プリントされたスマートフォン プラットフォームの作製と、デジタル画像処理ソフトウェア (ΔE および RGB) で分析されたアントシアニンの潜在的な反応を図 7 に示しました。実験セクションで詳細に説明したように、スマートフォン プラットフォームにはカメラ、LED、およびサンプル ホルダーはコンピューター支援設計 (CAD) ソフトウェアを使用して構築されました。 私たちのテストの動作メカニズムはアントシアニンの脱プロトン化に依存しており、脱プロトン化のレベルまたは反応環境のアルカリ性条件に基づいてさまざまな色が得られます。

パネル一体型 3D プリントスマートフォンプラットフォームの設計と、病原体検出のためのアントシアニンと色の pH 依存性反応。 (SOLIDWORKS Premium 2019 SP4.0 URL リンク: https://www.solidworks.com/3d experience-works)。

アントシアニンからの脱プロトン化により、アントシアニンの構造と電子密度が変化し、これらの両方がウレアーゼ試験溶液の色の変化に関与します。 たとえば、pH 6.5 で紫色に調製したテスト 1 のアントシアニンの分子構造は、図 7 の pH 4 ～ 7 で与えられたものと同じです。簡単に説明すると、アントシアニンの各ヒドロキシル基からの脱プロトン化は、対数酸解離定数に基づいて発生します。ウレアーゼ試験では、pH 6.5 から 12 までアルカリ条件の度合いとともに、脱プロトン化された水酸基の数 (pKa) が増加しました。pH 12 を超えると、水酸基の欠如によりアントシアニンの構造上の芳香環が加水分解されました。

結論として、私たちの研究は、アントシアニンが豊富な赤キャベツ (Brassica oleracea) 抽出物を pH 応答性の天然指示薬として論理的に調製し、モデル病原体検出用のセンサーとして利用できることを実証しました。 私たちは、肉眼と 3D プリントされたスマートフォン プラットフォームによる、プロテウス ミラビリスと肺炎桿菌のポータブル、迅速、高感度、経済的な検出を目的とした、アントシアニン ベースの比色ウレアーゼ センサーを設計しました。 また、反応環境中の細菌によるpH変化に対する脱プロトン反応によるアントシアニンの変色機構についても解説しました。 抗生物質の使用により大腸菌の増殖は完全に抑制され、検査では色の変化は見られませんでしたが、プロテウス・ミラビリスおよびクレブシエラ・ニューモニエ細菌株の存在は、人間の目とデジタル画像処理（ΔEおよびG/ B分析）。 有望な結果の一部として、モデル試験では 1 CFU/mL の肺炎桿菌と 1 CFU/mL のミラビリス プロテウスの存在さえも検出されました。 私たちは、優れた検出性能と低コストを備えたアントシアニンベースの比色ウレアーゼセンサーが、近い将来、多種多様な病原体を検出するために臨床現場に実装できることを提案しました。

この研究中に生成または分析されたデータのほとんどは、この原稿とその補足情報ファイルに含まれています。 その他の生データは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

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この研究は、エルジェス大学科学研究室から授与された助成金 (TDK-2021 10943) によって財政的に支援されています。

エルジェス大学薬学部分析化学学科、カイセリ、38039、トルコ

カグラ・チェリク & イスマイル・オクソイ

薬局サービス プログラム、保健サービス専門学校、ヒティット大学、コルム、19000、トルコ

カグラ・セリク

ナノテクノロジーおよびナノ医療部門、ハジェッテペ大学科学研究所、アンカラ、06800、トルコ

ナイム・ヤギズ・デミル & メメド・ドゥマン

エルジェス大学薬学部製薬微生物学科、38039、カイセリ、トルコ

ニレイ・イルディス

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CC は筆頭著者としてすべての実験と執筆に貢献しました。 CC、NYD、NI、MD が実験セクションに貢献しました。 このプロジェクトは、IOIO によって伝えられ、設計され、すべての実験が指導されました。 著者全員が原稿執筆に参加しました。

Nilay Ildiz または Ismail Ocsoy への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Celik、C.、Demir、NY、Duman、M. 他。 肉眼およびスマートフォンプラットフォームによるウレアーゼ陽性細菌の迅速かつ高感度かつ経済的な検出を可能にする、レッドキャベツ抽出物を介した比色センサー。 Sci Rep 13、2056 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-28604-1

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受信日: 2022 年 8 月 29 日

受理日: 2023 年 1 月 20 日

公開日: 2023 年 2 月 4 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28604-1

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